DNS szekvenálás és fragment analízis
Készülékünk:A szekvenálás ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer készülékkel történik, a futtatásokhoz a gyártótól (ABI) rendelt reagenseket használjuk, a mintafelvitelt az általuk megadott paraméterek szerint végezzük. A szekvenáló futás kapilláris elfo alapján történik. A szekvenálandó mintát egy PCR reakcióban fluoreszcensen jelölt dideoxi-NTP-kel kell jelölni, a reakcióban, a láncterminálás következtében különböző méretű jelölt fragmentek keletkeznek, amelyek a kapilláris elfo során elválnak. Az érzékelő ablakhoz érkező jelölt fragmentet lézer gerjeszti, a fluoreszcens jelet egy CCD kamera fogadja.
A szekvenálás:PCR termék, plazmid, és gDNS minták szekvenálását vállaljuk. 600-700 bázis hosszúságig tudunk szekvenálni, a szekvenciák a hatszázadik bázisig megbízhatóak. A szekvenciákra garanciát vállalunk abban az esetben, ha a mintákról mellékelve megkapjuk a minőségi ellenőrzés adatait (agaróz gél fotó, OD ratio >1.7, koncentráció). Minden polimer feltöltés után ellenőrizzük a készülékünk működését egy gyári kontroll minta futtatásával (310/377/3100/3100-Avant™/3130/3130xl Genetic Analyzer Sequencing Standards, BigDye® Terminator v3.1). Ezért ha a kontroll minta futása sikeres, de a megrendelőé hibás, nem vállalunk felelősséget a hibáért. A sikertelen illetve a megismételt szekvenálás költségeit a megrendelőnek kell vállalnia. Természetesen megpróbálunk tanácsot adni a hibás mintákkal kapcsolatban.
Általunk preferált, fogadott minták:1. Szekvenálási reakció után tisztított, beszárított termék. 2. Kis mintaszám esetében a szekvenálási reakciót is vállaljuk, ebben az estben a DNS templátot és a primert kérjük.
Fragment analízis (mikroszatellita elemzés, genotipizálás):Készülékünkön a D filterre van kalibrációval a következő festékeket tudjuk detektálni: 6FAM, HEX, NED, ROX. A futtatáshoz szükségünk van 5ul PCR termékre, amely tartalmazza a jelölt fragmenteket, illetve a Size Standard-ra 1ul/minta. A fragment analízissel kapcsolatban felmerülő további kérdésekkel (kitek, reakció optimalizálás) kérjük forduljon az Applied Biosystems/LifeTechologies képviselőihez.
Minta előkészítés szekvenálásra:PCR termék esetében fontos, hogy egy konkrét terméket használjunk templátként. Ha gélen futtatva több termék is látszik, akkor a megfelelő méretű terméket a gélből ki kell tisztítani. Plazmidok esetében ügyeljünk arra, hogy a kultúránkat 1 klónból indítsuk. Minden esetben ügyeljünk arra, hogy alkohol ne maradjon a mintában. A szekvenáló PCR reakció során a mintákat jelölni kell ddNTP-kel, a reakcióban a primer párnak csak az egyik tagját kell használni. A jelölt terméket meg kell tisztítani a be nem épült ddNTP-től, majd be kell szárítani.
Eredmények:
I. Szekvenálás:A futtatások eredményét mintánként két fájl tartalmazza. A ’seq’ kiterjesztésű a szekvenciát tartalmazza, ’txt’ fájlként megnyitható. Az ‘ab1’ kiterjesztésű fájl tartalmazza az elektroferogrammot, a következő ingyenes programokkal megnyitható. • EditView software, Applied Biosystems (Macintosh OS 9.x, 1.5 Mbytes). • FinchTV software (Macintosh OS X, Windows, Linux). • 4Peaks (Macintosh OS X). • Chromas software (Windows/DOS). II. Fragment analízis:Egy ’fsa’ kiterjesztésű fájl mintánként, amely az Applied Biosystems által forgalmazott programmal megnyitható Genotyping Software. |
Elérhetőségek
|